灭菌办法

灭菌法系指用恰当的物理或化学手法将物品中活的微生物杀灭或除掉，从而使物品残存活微生物的概率降低**预期的无菌确保水平的办法。本法适用于制剂、质料、辅料及医疗器械等物品的灭菌。

无菌物品是指物品中不含任何活的微生物。关于任何一批灭菌物品而言，肯定无菌无法确保，也无法用实验来证实。一批物品的无菌特性只能相对地经过物品中活微生物的概率低**某个可接受的水平来表述，即无菌确保水平(Sterility assurance level，简称SAL)。实践出产进程中，灭菌是指将物品中污染微生物的概率降低**预期的无菌确保水平。终究灭菌的物品微生物存活概率，即无菌确保水平不得高于10－6。已灭菌物品到达的无菌确保水平可经过验证断定。
灭菌物品的无菌确保不能依赖于终究商品的无菌查验，而是取决于出产进程中选用合格的灭菌技能、严厉的GMP管理和良好的无菌确保体系。灭菌技能的断定应综合思考被灭菌物品的性质、灭菌办法的有用性和经济性、灭菌后物品的完整性和安稳性等要素。
灭菌程序的验证是无菌确保的必要条件。灭菌程序经验证后，方可交付正式运用。验证内容包括：
(1)编撰验证计划及拟定评价规范。
(2)承认灭菌设备技能资料齐全、装置正确，并能处于正常运转(装置承认)。
(3)承认灭菌设备、要害操控和记载体系能在规则的参数范围内正常运转(运转承认)。
(4)选用被灭菌物品或模仿物品按预订灭菌程序进行重复实验，承认各要害技能与参数契合预订规范，断定经灭菌物品的无菌确保水平契合规则(性能承认)。
(5)汇总并完善各种文件和汜录，编撰验证陈述。
平时出产中，应对灭菌程序的运转状况进行监控，承认要害参数(如温度、压力、时刻、湿度、灭菌气体浓度及吸收的辐照剂量等)均在验证断定的范围内。灭菌程序应定时进行再验证。当灭菌设备或程序发作改动(包括灭菌物品装载办法和数量的改动)时，应进行再验证。
物品的无菌确保与灭菌技能、灭菌前物品被污染的程度及污染菌的特性有关。因而，应根据灭菌技能的特色拟定灭菌物品灭菌前的微生物污染水平及污染菌的耐受极限并进行监控，并在出产的各个环节采纳各种办法降低污染，确保微生物污染操控在规则的极限内。
灭菌的冷却期间。应采纳办法避免已灭菌物品被再次污染。任何状况下，都应请求容器及其密封体系确保物品在有用期内契合无菌请求。
灭菌办法
常用的灭菌办法有湿热灭菌法、干热灭菌法、辐射灭菌法、气体灭菌法和过滤除菌法。可根据被灭菌物品的特性选用一种或多种办法组合灭菌。只需物品答应，应尽也许选用终究灭菌法灭菌。若物品不适合选用终究灭菌法，可选用过滤除菌法或无菌出产技能到达无菌确保请求，只需也许，应对非终究灭菌的物品作弥补性灭菌处理(如流转蒸汽灭菌)。
一、湿热灭菌法
本法系指将物品置于灭菌柜内运用高压饱满蒸汽，过热水喷淋等手法使微生物菌体中的蛋白质、核酸发作变性而杀灭微生物的办法。该法灭菌能力强．为热力灭菌中**有用、运用**广泛的灭菌办法。药品、容器、培育基、无菌衣、胶塞以及别的遇高温文湿润不发作变化或损坏的物品。均可选用本法灭菌。流转蒸汽不能彻底杀灭细菌孢子，通常可作为不耐热无菌商品的辅佐灭菌手法。
湿热灭菌条件的挑选应思考灭菌物品的热安稳性、热穿透力、微生物污染程度等要素。湿热灭菌条件通常选用121℃×15min、121℃×30min或116℃×40min的程序，也可选用别的温度和时刻参数，但不管选用何种灭菌温度和时刻参数，都有必要证实所选用的灭菌技能和监控办法在正常运转进程中能确保物品灭菌后的SAL≤10－6。当灭菌程序的选定选用F0值概念时(F0值为规范灭菌时刻，系灭菌进程赋予被灭菌物品121℃下的灭菌时刻)，应采纳格外办法确保被灭菌物品能得到满足的无菌确保，此刻，除对灭菌程序进行验证外，还有必要在出产进程中对微生物进行监控，证实污染的微生物目标低于设定的极限。对热安稳的物品，灭菌技能可**过度杀灭法，以确保被灭菌物品取得满足的无菌确保值。热不安稳性物品，其灭菌技能的断定依赖于在必定的时刻内，必定的出产批次的被灭菌物品灭菌前微生物污染的水平及其耐热性。因而，平时出产全进程应对商品中污染的微生物进行接连地、严厉地监控．并采纳各种办法降低物品微生物污染水平，格外是避免耐热菌的污染。热不安稳性物品的F0值通常不低干8min。
选用湿热灭菌器进行湿热灭菌时，被灭菌物品应有恰当的装载办法，不能摆放过密，以确保灭菌的有用性和均一性。
湿热灭菌法应承认灭菌柜在不一样装载时也许存在的冷点。当用生物指示剂进一步承认灭菌作用时，应将其置于冷点处。水法常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus)。
二、干热灭菌法
本法系指将物品置于干热灭菌柜、地道等灭菌器设备中，运用干热空气到达杀灭微生物或消除热原物质的办法。适用于耐高温但不宜用湿热灭菌法灭菌的物品灭菌，如玻璃用具、金属制容器、纤维成品、固体试药、液状白腊等均可选用本法灭菌。
干热火菌条件通常为160～170℃×120min以上、170～l80℃×60min以上或250℃×45min以上，也可选用别的温度和时刻参数。不管选用何种灭菌条件，均应确保灭菌后的物品的SAL≤10－6。选用干热过度杀灭后的物品通常无需进行灭菌前污染微生物的测定。250℃×45min的干热灭菌也可除掉无菌商品包装容器及有关出产灌装用具中的热原物质。#p#分页标题#e#
采州干热灭菌时，被灭菌物品应有恰当的装载办法，不能摆放过密，以确保灭菌的有用性和均一性。
干热灭菌法应承认灭菌柜中的温度散布契合设定的规范及断定**冷点方位等。常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)。细菌内毒素灭活验证实验是证实除热原进程有用性的实验。通常将不小于1000单位的细菌内毒素参加待去热原的物品中，证实该去热原技能能使内毒素**少降低3个对数单位。细菌内毒素灭活验证实验所用的细菌内毒素通常为大肠埃希菌内毒素(Escherichia coliendoxin)。
三、辐射灭菌法
本法系指将物品置于适合放射源辐射的γ射线或适合的电子加速器发作的电子束中进行电离辐射而到达杀灭微生物的办法。本法**常用的为60Co-γ射线辐射灭菌。医疗器械、容器、出产辅佐用品、不受辐射损坏的质料药及成品等均可用本法灭菌。
选用辐射灭菌法灭菌的无菌物品其SAL应≤10－6。γ射线辐射灭菌所操控的参数主要是辐射剂量(指灭菌物品的吸收剂量)。泫剂量的拟定应思考灭菌物品的适应性及也许污染的微生物**大数量及**强抗辐射力，事先应验证所运用的剂量不影响被灭菌物品的安全性、有用性及安稳性。常用的辐射灭菌吸收剂量为25kGy。对终究商品，质料药、某些医疗器件应尽也许选用低辐射剂量灭菌。灭菌前，应对被灭菌物品微生物污染的数量和抗辐射强度进行测定，以评价灭菌进程赋予该灭菌物品的无菌确保水平。关于已设定的剂量，应定时审阅，以验证其有用性。
灭菌时，应选用恰当的化学或物理办法对灭菌物品吸收的辐射剂量进行监控。以充沛证实灭菌物品吸收的剂量是在规则的极限内。如选用与灭菌物品一同被辐射的放射性剂量计，剂量计要置于规则的部位。在初装置时剂量计运用规范源进行校对，并定时进行再校对。
60Co-γ射线辐射灭菌法常用的生物指示剂为矮小芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus pumilus)。
四、气体灭菌法
本法系指用化学消毒剂构成的气体杀灭微生物的办法。常用的化学消毒剂有环氧乙烷、气态过氧化氢、甲醛、臭氧(O3)等，本法适用于在气体中安稳的物品灭菌。选用气体灭菌法时，应注意灭菌气体的可燃可爆性、致畸性和残留毒性。
本法中**常用的气体是环氧乙烷，通常与80％～90％的慵懒气体混合运用，在充有灭菌气体的高压腔室内进行。该法可用于医疗器械，塑料成品等不能选用高温灭菌的物品灭菌。含氯的物品及能吸附环氧乙烷的物品则不宜运用本法灭菌。
选用环氧乙烷灭菌时，灭菌柜内的温度、湿度、灭菌气体浓度、灭菌时刻是影响灭菌作用的主要因数。可选用下列灭菌条件：
    温度              54℃±10℃
    相对湿度          60％±10％
    灭菌压力          8×105Pa
    灭菌时刻          90min
灭菌条件应予验证。灭菌时，将灭菌腔室抽成真空，然后通入蒸汽使腔室内到达设定的温湿度平衡的额定值，再通入经过滤和预热的环氧乙烷气体。灭菌进程中，应紧密监控腔室的温度、湿度、压力、环氧乙烷浓度及灭菌时刻。必要时运用生物指示剂监控灭菌作用。本法灭菌程序的操控具有必定难度，整个灭菌进程应在技能娴熟人员的监督下进行。灭菌后，应采纳新鲜空气置换，使残留环氧乙烷和别的易挥发性残留物散失。并对灭菌物品中的环氧乙烷残留物和反响商品进行监控，以证实其不超越规则的浓度，避免发生毒性。    ·
选用环氧乙烷灭菌时，应进行泄漏实验，以承认灭菌腔室的密闭性。灭菌程序承认时，还应思考物品包装资料和灭菌腔室巾物品的摆放办法对灭菌气体的分散和浸透的影响。生物指示剂通常选用枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis)。
五、过滤除菌法
本法系运用细菌不能经过细密具孔滤材的原理以除掉气体或液体中微生物的办法。常用于气体、热不安稳的药品溶液或质料的除菌。
除菌过滤器选用于孔径散布均匀的微孔滤膜作过滤资料，微孔滤膜分亲水性和疏水性两种。滤膜原料依过滤物品的性质及过滤意图而定。约品牛产十选用的除菌滤膜孔径通常不超越0.22μm。过滤器的孔径界说来自过滤器对微生物的截留，而非均匀孔径的散布系数。所以，用于终究除菌的过滤器有必要挑选具有截流实验证实的除菌级过滤器。过滤器对滤液的吸附不得影响药品质量，不得有纤维掉落，禁用含石棉的过滤器。过滤器的运用者应了解滤液过滤进程中的分出物性质、数量并评价其毒性影响。滤器和滤膜在运用前应进行洁净处理，并用高压蒸汽进行灭菌或作在线灭菌。替换种类和批次应先清洗滤器，再替换滤芯或滤膜或直接替换滤器。
过滤进程中无菌确保与过滤液体的初始生物负荷及过滤器的对数降低值LRV(log reduction value)有关。LRV系指规则条件下．被过滤液体过滤前的微生物数量与过滤后的微生物数量比的常用对数值。
即：    LRV=lgN0－lgN
式中   N0为商品除菌前的微生物数量。
       N为商品除菌后的微生物数量。#p#分页标题#e#
LRV用于表明过滤器的过滤除菌功率，对孔径为0.22μm的过滤器而言，请求每1cm2有用过滤面积的LRV应不小于7。因而过滤除菌时，被过滤商品总的污染量应控  制在规则的极限内。为确保过滤除菌作用，可运用两个除菌级的过滤器串连过滤，或在灌装前用过滤器进行再次过滤。
在过滤除菌中，通常无法对全进程中过滤器的要害参数(滤膜孔径的巨细及散布，滤膜的完整性及LRV)进行监控。因而，在每一次过滤除菌前后均应作滤器的完整性实验，即气泡点实验或压力保持实验或气体分散流量实验，承认滤膜在除菌过滤进程中的有用性和完整性。完整性的测验规范来自于有关细菌载留实验数据。除菌过滤器的运用时刻应进行验证，通常不该超越一个工作日，否则应进行验证。
过滤除菌法常用的生物指示剂为缺点假单胞菌(Pseudomonas diminuta)。
经过过滤除菌法到达无菌的商品应紧密临控其出产环境的洁净度，应在无菌环境下进行过滤操作。有关的设备、包装容器、塞子及别的物品应选用恰当的办法进行灭菌，并避免再污染。
六、无菌出产技能
无菌出产技能系指有必要在无菌操控条件下出产无菌制剂的办法，无菌分装及无菌冻干是**常见的无菌出产技能。后者在技能进程中须选用过滤除菌法。
无菌出产技能应紧密监控其出产环境的洁净度，并应在无菌操控的环境下进行过滤操作。有关的设备、包装容器、塞子及别的物品应选用恰当的办法进行灭菌。并避免被再次污染。
无菌出产技能进程的无菌确保应经过培育基无菌灌装模仿实验验证。在出产进程中，应紧密监控出产环境的无菌空气质量、操作人员的本质、各物品的无菌性。
无菌出产技能应定时进行验证．包括对环境空气过滤体系有用性验证及培育基模仿灌装实验。
生物指示剂
生物指示剂系一类特别的活微生物成品，可用于承认灭菌设备的性能、灭菌程序的验证、出产进程灭菌作用的监控等。用于灭菌验证中的生物指示剂通常是细菌的孢子。
1．制备生物指示剂用微生物的基本请求
不一样的灭菌办法运用不一样的生物指示剂，制备生物指示剂所选用的微生物有必要具有以下特性：
(1)菌种的耐受性应大于需灭菌商品中所有也许污染菌的耐受性。
(2)菌种应无致病性。
(3)菌株应安稳。存活期长，易于保存。
(4)易于培育。若运用休眠孢子，生物指示剂中休眠孢子含量要在90％以上。
2．生物指示剂的制备
生物指示剂的制备应按必定的程序进行，制备前，需先断定所用微生物的特性，如D值(微生物的耐热参数，系指必定温度下，将微生物杀灭90％所需的时刻，以分钟表明)等。菌株运用适官的培育基进行培育。培育物应制成悬浮液，其间孢子的数量应占优势，孢子应悬浮于无养分的液体中保存。
生物指示剂中包括必定数量的一种或多种孢子。可制成多种方式。通常是将必定数量的孢子附着在慵懒的载体上，如滤纸条、玻片、不锈钢、塑料成品等：孢子悬浮液也可密封于安瓿中；有的生物指示剂还配有培育基体系。D值除与灭菌条件有关外，还与微生物存在的环境有关。因而，必定方式的生物指示剂制备完成后，应测定D值和孢子总数。生物指示剂应选用适宜的资料包装，并设定有用期。载体和包装资料在维护生物指示剂不致污染的一起，还应确保灭菌剂穿透并能与生物指示剂充沛触摸。载体和包装的规划·原则是便于储存、运送、取样、搬运接种。
有些生物指示剂可直接将孢子接种**液体灭菌物或具有与其类似的物理和化学特性的替代品中。运用替代品时，运用数据证实二者的等效性。
3．生物指示剂的运用
在灭菌程序的验证中，虽然可经过灭菌进程某些参数的监控来评价灭菌作用，但生物指示剂的被杀灭程度，则是评价一个灭菌程序有用性**直观的目标。可运用市售的标    准生物指示剂，也可运用由平时出产污染菌监控中别离耐受性**强的微生物制备的孢子。在生物指示剂验证实验中，需断定孢子在实践灭菌条件下的D值，并测定孢子的纯度和数量。验证时，生物指示剂的微生物用量应比平时检出的微生物污染量大，耐受性强，以确保灭菌程序有更大的安全性。在终究灭菌法中，生物指示剂应听任灭菌柜的不一样部位。并避免指示剂直接触摸到被灭菌物品。生物指示剂按设定的条件灭菌后取出，分别置培育基中培育，断定生物指示剂中的孢子是否被彻底杀灭。
过度杀灭商品灭菌验证通常不思考微生物污染水平，可选用市售的生物指示剂。对灭菌手法耐受性差的商品，规划灭菌程序时，根据经验预计在该出产技能中商品微生物污染的水平，挑选生物指示剂的菌种和孢子数量。这类商品的无菌确保应经过监控每批灭菌前的微生物污染的数量、耐受性和灭菌程序验证所取得的数据进行评价。
4．常用生物指示剂
(1)湿热灭菌法 湿热灭菌法**常用的牛物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus stearothermophilus，如NCTC 10007、NCIMB 8157、ATCC 7953)。D值为1.5～  3.0min，每片(或每瓶)活孢子数5×105～5×106个，在121℃、19min下应被彻底杀灭。此外，还可运用生孢梭菌孢子(Spores of Clostridium sporogenes，如NCTC 8594、NCIMB 8053、ATCC 7955)，D值为0.4～0.8min。
(2)干热灭菌法  干热灭菌法**常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌抱子(Spores of Bacillus subtilis，如NCIMB 8058、ATCC 9372)。D值大于1.5min，每片活孢子数5×105～5×106个。去热原验证时运用大肠埃希菌内毒素(Escherichia coliendomn)，加量不小于1000细菌内毒索单位。#p#分页标题#e#
(3)辐射灭菌法  辐射灭菌法**常用的生物指示剂为矮小芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus pumilus，如NCTC 10327、NCIMB 10692、ATCC 27142)。每片活抱子数107～108，置于放射剂量25kGy条件下，D值约3kGy。但应注意灭菌物品中所负载的微生物也许比矮小芽孢杆菌孢子显现更强的抗辐射力。因而矮小芽孢杆菌孢子可用于监控灭菌进程，但不能用于灭菌辐射剂量树立的根据。
(4)气体灭菌法  环氧乙烷灭菌**常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus subtilis，如NCTC 10073、ATCC 9372)。气态过氧化氢灭菌**常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(Spores of Bacillus steatothermophilus，如NCTC 10007、NCIMB 8157、ATCC 7953)。每片活孢子数1×106～5×106个。环氧乙烷灭菌中，枯草芽孢杆菌孢子D值大于2.5min，在环氧乙烷浓度为600mg／L，相对湿度为60％，温度为54℃下灭菌，60min应被杀灭。
(5)过滤除菌法  过滤除菌法**常用的生物指示剂为缺点假单胞菌(Pseudomonas diminuta，如ATCC 19146)，用于滤膜孔径为0.22μm的滤器；黏质沙雷菌(Serratia  marcescens)(ATCC 1 4756)用于滤膜孔径为0.45μm的滤器。