微生物灭菌原理与方法

灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者要清楚有菌和无菌的范畴。有菌的范畴是:凡是暴露在空气中的物体,接触自然水源的物体,**少它的表面都是有菌的。依此观点,无菌室等未处理的地方、超净台的表面、简单煮沸的培养基、我们使用的刀、剪在未处理之前、我们身体的整个外表及与外界相连的内表,如整个消化道、呼吸道,即我们呼出的气体、培养容器无论洗得多干净等等都是有菌的。
     这里所指的菌,包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其他微生物。菌的特点是:极小,肉眼看不见。无处不在,无时不有,无孔不入。在自然条件下忍耐力强,生活条件要求简单,繁殖力极强,条件适宜时便可大量滋生。
     无菌的范畴是:经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体,经其他物理或化学的灭菌方法处理后的物体(当然这些方法必须已经证明是有效的),高层大气、岩石内部、健康的动、植物的不与外部接触的组织内部,强酸强碱,化学元素灭菌剂等表面和内部都是无菌的。从以上可以看出:在地球表面无菌世界要比有菌世界小的多。
     灭菌是指用物理或化学的方法,杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体,即把所有生命的物质全部杀死。与此相关的一个概念是消毒,它指杀死、消除或充分抑制部分微生物,使之不再发生危害作用,显然经过消毒,许多细菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不会完全杀死,即由于在消毒后的环境里和物品上还有活着的微生物,所以通过严格灭菌的操作空间(接种、超净台等)和使用的器皿,以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行的操作,就叫做无菌操作。
     植物组织培养对无菌条件的要求是非常严格的,甚**超过微生物的培养要求,这是因为培养基含有丰富的营养,稍不小心就引起杂菌污染。要达到彻底灭菌的目的,必须根据不同的对象采取不同的切实有效的方法灭菌,才能保证培养时不受杂菌的影响,使试管苗能正常生长。
    常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即:物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施;化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。
    1、培养基用湿热灭菌
    培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是:在密闭的蒸锅内,其中的蒸汽不能外溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下,锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下,可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
    注意完全排除锅内空气,使锅内全部是水蒸气,灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法,但目的都是要排净空气,使锅内均匀升温,保证灭菌彻底。常用方法是:关闭放气阀,通电后,待压力上升到0.05MPa时,打开放气阀,放出空气,待压力表指针归零后,再关闭放气阀。
    关阀再通电后,压力表上升达到0.1MPa时,开始计时,维持压力0.1-0.15MPa,20分钟。
    按容器大小不同,保压时间有所不同,见表。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字,如果容器体积较大,但是放置的数量很少,也可以减少时间。
培养基高压蒸汽灭菌所必需的**少时间
容器的体积/mL 在121℃灭菌所需**少时间/min
20-50 15
75-150 20
250-500 25
1000 30
     到达保压时间后,即可切断电源,在压力到0.5MPa,可缓慢放出蒸汽,应注意不要使压力降低太快,以致引起激烈的减压沸腾,使容器中的液体四溢。当压力降到零后,才能开盖,取出培养基,摆在平台上,以待冷凝。不可久不放气,引起培养基成分变化,以**培养基无法摆斜面。一旦放置过久,由于锅炉内有负压,盖子打不开,只要将放气阀打开,大气压入,内外压力平衡,盖子便易打开了。
    对高压灭菌后不变质的物品,如无菌水、栽培介质、接种工具,可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间,既要保压彻底,又要防止培养基中的成分变质或效力降低,不能随意延长时间。
     对于一些布制品,如实验衣、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好,高压灭局20-30分钟。
     高压灭菌前后的培养基,其PH值下降0.2-.3单位。高压后培养基PH值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用碱调高PH值**预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时,高压灭菌后的PH值变化幅度较大,甚**可大于2个PH值单位。环境PH值的变化大于0.5单位就有可能产生明显的生理影响。

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