组织培养时各种灭菌特点

常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即:物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施;化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。 
1、培养基用湿热灭菌
培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是:在密闭的蒸锅内,其中的蒸汽不能外溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下,锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下,可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
注意完全排除锅内空气,使锅内全部是水蒸气,灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法,但目的都是要排净空气,使锅内均匀升温,保证灭菌彻底。常用方法是:关闭放气阀,通电后,待压力上升到0.05MPa时,打开放气阀,放出空气,待压力表指针归零后,再关闭放气阀。
关阀再通电后,压力表上升达到0.1MPa时,开始计时,维持压力0.1-0.15MPa,20分钟。
按容器大小不同,保压时间有所不同,见表。该表所列数字是彻底灭菌很保险的数字,如果容器体积较大,但是放置的数量很少,也可以减少时间。 
培养基高压蒸汽灭菌所必需的**少时间
容器的体积/mL 在121℃灭菌所需**少时间/min
20-50 15
75-150 20
250-500 25
1000 30
到达保压时间后,即可切断电源,在压力到0.5MPa,可缓慢放出蒸汽,应注意不要使压力降低太快,以致引起激烈的减压沸腾,使容器中的液体四溢。当压力降到零后,才能开盖,取出培养基,摆在平台上,以待冷凝。不可久不放气,引起培养基成分变化,以**培养基无法摆斜面。一旦放置过久,由于锅炉内有负压,盖子打不开,只要将放气阀打开,大气压入,内外压力平衡,盖子便易打开了。
对高压灭菌后不变质的物品,如无菌水、栽培介质、接种工具,可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间,既要保压彻底,又要防止培养基中的成分变质或效力降低,不能随意延长时间。
对于一些布制品,如实验衣、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好,高压灭局20-30分钟。
高压灭菌前后的培养基,其PH值下降0.2-.3单位。高压后培养基PH值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用碱调高PH值**预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时,高压灭菌后的PH值变化幅度较大,甚**可大于2个PH值单位。环境PH值的变化大于0.5单位就有可能产生明显的生理影响。
高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖,从而改变培养基的渗透压。在8%-20%蔗糖范围内,高压灭菌后的培养基约升高0.43倍。
培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解,可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于5.5,其水解量更多,培养基中添加0.1%活性炭时,高压下蔗糖水解大大增强,添加1%活性炭,蔗糖水解率可达5%。
为防止高压灭菌产生的上诉一些变化可用下列方法:
(1)经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料,以便及时采取有效措施。
(2)设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇,以IBA代替IAA,控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意PH值对高压灭菌下培养基中成分的影响等。
(3)配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序。如将磷、钙和铁放在**后加入。
(4)注意高压灭菌后培养基PH值的变化及回复动态。如高压灭菌后的PH值常由5.8升高**6.48。而96小时后又回降**5.8左右。这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握。
2、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌
在无菌操作时,把镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中,使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后,立即使用。操作中可采用250或500毫升的广口瓶,放入95%的酒精,以便插入工具。
3、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌
干热灭菌是利用烘箱加热到160-180℃的温度来杀死微生物。由于在干热条件下,细菌的营养细胞的抗热性大为提高,接近芽孢的抗热水平,通常采用170℃持续90分钟来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥,工具等要妥为包扎,以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温,达到预定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多,以免防碍热对流和穿透,到指定时间断电后,待充分冷凉,才能打开烘箱,以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大,浪费时间。
4、不耐热的物质采用过滤灭菌
一些生长调节剂,如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些微生物是不耐热的,不能用高压灭菌处理,通常采用过滤灭菌方法。
一些化学成分在高温高压下回发生降解而失去效能或降低效能。经高温灭菌后赤霉素GA3的活性仅及不经高温灭菌的新鲜溶液的10%。蔗糖经高温后部分被降解成D-葡萄糖和D-果糖,果糖又可被部分水解,产生抑制培养的植物组织生长的物质。高温还可使碳水化合物和氨基酸发生反应。IAA,NAA,2,4-D、激动素和玉米素在高温下是比较稳定的。维生素具有不同程度的热稳定性,但如果培养基的PH值高于5.5,则维生素B1会被迅速降解。泛酸钙、植物组织提取物等要过滤灭菌,不能高温灭菌,否则会失去作用。
防细菌滤膜的网孔的直径为0.45微米以下,当溶液通过滤液后,细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻,在需要过滤灭菌的液体量大时,常使用抽滤装置;液量小时,可用注射器。使用前对其高压灭菌,将滤膜装在注射器的靠针管处,将待过滤的液体装入注射器,推压注射器活塞杆,溶液压出滤膜,从针管压出的溶液就是无菌溶液。
过滤除菌操作步骤:首先将过滤器、接液瓶用纸包好,滤膜可放在培养皿内用纸包好。使用前先经121℃高压蒸汽灭菌30分钟;在超净工作台上,将滤器装置装好,用灭菌无齿镊子将滤膜安放在隔板上,滤膜粗糙面向上;然后将待除菌的液体注入滤器内,开动真空泵即可过滤除菌。滤液经培养证明无菌生长后可保存备用。 
5、空间采用紫外线和熏蒸灭菌
(1)紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种箱用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌,细菌吸收紫外线后,蛋白质很核酸发生结构变化,引起细菌的染色体变异,造成死亡。紫外线的波长为200-300nm,其中260nm的杀菌能力**强,但是由于紫外线的穿透能力很弱,所以只适于空气和物体表面的灭菌,而且要求距照射物以不超过1.2米为宜。
(2)熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法,使化学药剂变为气体状态扩散到空气中,以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便,只需要把消毒的空间关闭紧密即可。
化学消毒剂的种类很多,它们使微生物的蛋白质变性,或竞争其酶系统,或降低其表面张力,增加菌体细胞浆膜的通透性,使细胞破裂或溶解。一般说来,温度越高,作用时间越长,杀菌效果越好。另外,由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用,所以要制成水溶状态,如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大,杀菌能力越强,但石炭酸和酒精例外。
常用熏蒸剂是甲醛,熏蒸时,房间关闭紧密,按5-8ml/m3用量,将甲醛置于广口容器中,加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时,房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸,但效果不如甲醛。
6、一些物体表面用药剂喷雾灭菌
物体表面可用一些药剂涂搽,喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等,可用75%的酒精反复涂搽灭菌,1%-2%的来苏儿溶液以及0.25%-1%的新洁尔灭也可以。
7、植物材料表面用消毒剂灭菌
从外界或室内选取的植物材料,都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基,便会造成培养基污染。因此,植物材料必须经严格的表面灭菌处理,再经无菌操作手续接种到培养基上,这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体(explant)。
首先,将采来的植物材料除去不用的部分,将需要的部分仔细洗干净,如用适当的刷子等刷洗。把材料切割成适当大小,即灭菌容器能放入为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟**数小时,冲洗时间视材料清洁程度而宜。易漂浮或细小的材料,可装入纱布袋内冲洗。流水冲洗在污染严重时特别有用。
洗时可加入洗衣粉清洗,然后再用自来水冲洗洗衣粉水。洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物,除去脂质性的物质,便于灭菌液的直接接触。当然,**理想的清洗物质是表面活性物质吐温。
第二步是对材料的表面浸润灭菌。要在超净台或接种箱内完成,准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。用70%酒精浸10-30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用,加之70%酒精穿透力强,也很易杀伤植物细胞,所以浸润时间不能过长。有一些特殊的材料,如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗,多层鳞片的休眠芽等等,以及主要取用内部的材料,则可只用70%酒精处理稍长的时间。处理完的材料在无菌条件下,待酒精蒸发后再剥除外层,取用内部材料。
第三步是用灭菌剂处理。表面灭菌剂的种类较多,可根据情况选取1-2种使用见下表。
常用灭菌剂使用浓度及效果比较表
灭菌剂名称 使用浓度% 消毒难易 灭菌时间 灭菌效果
酒精 70-75 易 0.1-3 好
氯化汞 0.1-0.2 较难 2-10 **好
漂白粉 饱和溶液 易 5-30 很好
次氯酸钙 9-10 易 5-30 很好
次氯酸钠 2(活性氧) 易 5-30 很好
过氧化氢 10-12 **易 5-15 好
抗菌素 4-50mg/L 中 30-60 较好
上述灭菌剂应在使用前临时配制,氯化汞可短期内储用。次氯酸钠和次氯酸钙都是利用分解产生氯气来杀菌的,故灭菌时用广口瓶加盖较好;升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的;过氧化氢是分解中释放原子态氧来杀菌的,这种药剂残留的影响较小,灭菌后用无菌水漂洗3-4次即可;由于升汞液灭菌的材料,难以对升汞残毒去除,所以应当用无菌水漂洗8-10次,每次不少于3分钟,以尽量去除残毒。
灭菌时,不沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中,记好时间,倒入消毒溶液,不时用玻璃棒轻轻搅动,以促进材料各部分与消毒溶液充分接触,驱除气泡,使消毒彻底。在快到时间之前1-2分钟,开始把消毒液倾入一备好的大烧杯内,要注意勿使材料倒出,氢净后立即倒入无菌水,轻搅漂洗。灭菌时间是从倒入消毒液开始,**倒入无菌水时为止。记录时间还便于比较消毒效果,以便改正。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液,切勿勉强在一个体积偏小的容器中使用很多材料灭菌。
在灭菌溶液中加吐温-80或Triton X效果较好,这些表面活性剂主要作用是使药剂更易于展布,更容易浸入到灭菌的材料表面。但吐温加入后对材料的伤害也在增加,应注意吐温的用量和灭菌时间,一般加入灭菌液的0.5%,即在100ml加入15滴。
**后一步是用无菌水漂洗,漂洗要求3分钟左右,视采用的消毒液种类,漂洗3-10次左右。无菌水漂洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。

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